Stage M2 : Étude des voies de signalisation dépendantes de l'O₂ dans la formation du bois de peuplier

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Présentation INRAE

L’Institut national de recherche pour l’agriculture, l’alimentation et l’environnement (INRAE) est un établissement public de recherche rassemblant une communauté de travail de 12 000 personnes, avec 272 unités de recherche, de service et expérimentales, implantées dans 18 centres sur toute la France. INRAE se positionne parmi les tout premiers leaders mondiaux en sciences agricoles et alimentaires, en sciences du végétal et de l’animal. Ses recherches visent à construire des solutions pour des agricultures multi-performantes, une alimentation de qualité et une gestion durable des ressources et des écosystèmes.

Environnement de travail, missions et activités

Contexte scientifique et enjeux

Le bois, aussi appelé xylème secondaire, joue un rôle important dans le stockage du carbone et une ressource d’importance économique pour la production de bioénergie et la fabrication de matériaux. Il est produit à partir du cambium, un méristème secondaire composé de cellules indifférenciées. Ces cellules subissent un processus de différenciation complexe pour produire des cellules spécialisées, caractérisées par la présence de parois cellulaires secondaires épaisses et lignifiées¹.

L’oxygène (O₂) est une molécule gazeuse qui joue un rôle clé dans le développement des plantes et leur réponse au stress, comme les inondations. Chez les plantes, la concentration en O₂ varie selon les tissus et types cellulaires. Par exemple, les cellules métaboliquement très actives consomment l’O₂ plus vite qu’elles n’en produisent, ce qui crée un environnement hypoxique². Les tissus physiquement isolés de l’O₂ ambiant sont également hypoxiques, tout comme ceux soumis à un stress d’inondation³. Chez les arbres, il est suggéré que le cambium serait hypoxique à cause des processus de différenciation qui consomment beaucoup d’O₂ et de la limitation de l’apport en O₂ externe⁴. Les mécanismes par lesquels les cellules cambiales et du xylème détectent et répondent aux variations des niveaux d’O₂ sont peu étudiés.

La voie du « N-degron » est un système protéolytique très conservé qui cible les protéines pour les dégrader en fonction de leur acide aminé N-terminal⁵. Chez les plantes, une branche de cette voie a été découverte dans laquelle le groupe de facteurs de transcription de réponse à l’éthylène du groupe VII (ERFVII), présentant un motif N-terminal particulier commençant par Met-Cys (MC), sont reconnus et ciblés pour être dégradés en présence de niveaux suffisants d’O₂^6,7.

Dans l’équipe d’accueil, un facteur de transcription R2R3 MYB de peuplier (MYB90) a commencé à être caractérisé⁸. MYB90 serait impliqué dans la formation du bois (xylogenèse)⁸. MYB90 possède le motif nécessaire (Met-Cys ; MC) qui pourrait le rendre susceptible d’être contrôlé par la teneur en O₂. Des résultats préliminaires montrent une accumulation de la protéine dans le cambium malgré une faible transcription du gène⁸. 

Objectif et plan de recherche

Le stage a pour objectif principal d’avancer dans la compréhension du rôle de l’O₂ dans le cambium pour contrôler la formation du bois chez le peuplier. 

Pour cela, le/la stagiaire aura comme mission :

1. Evaluer la stabilité du facteur de transcription MYB90 de peuplier dans un système in vitro. 

Le/la stagiaire réalisera le clonage de MYB90 sauvage et muté sur son motif MC par mutagénèse dirigée et mettra en place le système in vitro de réticulocyte de lapin pour réaliser des études de suivi de dégradation de MYB90^6,9.

2. Evaluer le profil d’expression des gènes clés liés à l’hypoxie et les niveaux protéiques de MYB90 dans le cambium et xylème de jeunes peupliers.

Pour cela, le/la stagiaire commencera par l’identification des orthologues chez le peuplier des gènes connus pour répondre au stress d’hypoxie chez Arabidopsis thaliana (« core hypoxia-responsive genes »)¹⁰. Ensuite, des amorces pour ces gènes seront conçues pour analyser l'abondance des transcrits par qPCR dans le cambium et le xylème secondaire. Les niveaux protéiques de MYB90 seront évalués par western blot avec un anticorps anti-MYB90 déjà disponible dans le laboratoire⁸.

3. Génération de lignées de peuplier knockout pour MYB90 et exprimant MYB90 tagué sauvage et muté.

Le/la stagiaire sera responsable du design des guides pour faire l’édition du gène par CRISPR Cas, le clonage de MC- et MA-MYB90 avec un tag à définir et la transformation sur le peuplier ainsi que le suivi des transformants. Cette partie du projet sera réalisé sur site dans le Laboratoire d'Ingénierie Cellulaire de l'Arbre (LICA ; https://lica.hub.inrae.fr/). Ces lignées seront cruciales pour la caractérisation fonctionnelle ultérieure de MYB90 dans la formation du bois. 

1.            Mauriat, M., Provost, G.L., Rozenberg, P., Delzon, S., Breda, N., Clair, B., Coutand, C., Domec, J.-C., Fourcaud, T., Grima-Pettenati, J., et al. (2014). Wood Formation in Trees. Tree Biotechnology, 56–111.

2.            Bailey-Serres, J., Fukao, T., Gibbs, D.J., Holdsworth, M.J., Lee, S.C., Licausi, F., Perata, P., Voesenek, L.A.C.J., and Dongen, J.T. van (2012). Making sense of low oxygen sensing. Trends in Plant Science 17, 129–138. https://doi.org/10.1016/j.tplants.2011.12.004.

3.            Loreti, E., and Perata, P. (2020). The Many Facets of Hypoxia in Plants. Plants (Basel) 9, 745. https://doi.org/10.3390/plants9060745.

4.            Spicer, R., and Holbrook, N.M. (2005). Within-stem oxygen concentration and sap flow in four temperate tree species: does long-lived xylem parenchyma experience hypoxia? Plant, Cell & Environment 28, 192–201. https://doi.org/10.1111/j.1365-3040.2004.01262.x.

5.            Bachmair, A., Finley, D., and Varshavsky, A. (1986). In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue. Science 234, 179–186. https://doi.org/10.1126/science.3018930.

6.            Gibbs, D.J., Lee, S.C., Md Isa, N., Gramuglia, S., Fukao, T., Bassel, G.W., Correia, C.S., Corbineau, F., Theodoulou, F.L., Bailey-Serres, J., et al. (2011). Homeostatic response to hypoxia is regulated by the N-end rule pathway in plants. Nature 479, 415–418. https://doi.org/10.1038/nature10534.

7.            Licausi, F., Kosmacz, M., Weits, D.A., Giuntoli, B., Giorgi, F.M., Voesenek, L.A.C.J., Perata, P., and van Dongen, J.T. (2011). Oxygen sensing in plants is mediated by an N-end rule pathway for protein destabilization. Nature 479, 419–422. https://doi.org/10.1038/nature10536.

8.            Lakhal, W. (2013). Etude fonctionnelle de trois facteurs de transcription impliqués dans la formation de la paroi secondaire chez le peuplier. Thèse, Université d’Orléans, 123p.

9.            Gibbs, D.J., Tedds, H.M., Labandera, A.-M., Bailey, M., White, M.D., Hartman, S., Sprigg, C., Mogg, S.L., Osborne, R., Dambire, C., et al. (2018). Oxygen-dependent proteolysis regulates the stability of angiosperm polycomb repressive complex 2 subunit VERNALIZATION 2. Nat Commun 9, 5438. https://doi.org/10.1038/s41467-018-07875-7.

10.          Mustroph, A., Lee, S.C., Oosumi, T., Zanetti, M.E., Yang, H., Ma, K., Yaghoubi-Masihi, A., Fukao, T., and Bailey-Serres, J. (2010). Cross-Kingdom Comparison of Transcriptomic Adjustments to Low-Oxygen Stress Highlights Conserved and Plant-Specific Responses1[W][OA]. Plant Physiol 152, 1484–1500. https://doi.org/10.1104/pp.109.151845.

Expérimentation en milieu confiné (L2)

Formations et compétences recherchées

Bonnes connaissances en biologie moléculaire. 

Connaissances en biochimie des protéines et biologie végétale seront un plus.

Votre qualité de vie à INRAE

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