Evaluation de l’effet de l’édition de différentes laccases sur les lignines de peuplier

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Présentation INRAE

L’Institut national de recherche pour l’agriculture, l’alimentation et l’environnement (INRAE) est un établissement public de recherche rassemblant une communauté de travail de 12 000 personnes, avec 272 unités de recherche, de service et expérimentales, implantées dans 18 centres sur toute la France. INRAE se positionne parmi les tout premiers leaders mondiaux en sciences agricoles et alimentaires, en sciences du végétal et de l’animal. Ses recherches visent à construire des solutions pour des agricultures multi-performantes, une alimentation de qualité et une gestion durable des ressources et des écosystèmes.

 

 

Environnement de travail, missions et activités

Contexte scientifique et enjeux

Le bois est une ressource renouvelable, utilisée comme matériau, matière première et source d’énergie. Son utilisation en tant que matériau est amenée à s’accroitre considérablement dans les années à venir car il permet le stockage de carbone à long terme et contribue à atténuer les effets des changements globaux. La lignine constitue 15 à 36 % de la matière sèche du bois. Indispensable au bon développement de l’arbre, elle joue un rôle essentiel dans le soutien mécanique, la conduction de la sève et la résistance aux attaques des pathogènes. En revanche, certaines applications industrielles, telles que la production de pâte à papier ou de bioéthanol, nécessitent son élimination par des traitements polluants et coûteux.

La lignine est un polymère tridimensionnel résultant de la polymérisation oxydative de trois types d’unités élémentaires appelés monolignols. Chez les arbres feuillus, la lignine est composée principalement d'unités S et G avec dans certains tissus la présence d’unités H. Ces trois monolignols diffèrent par le degré de méthoxylation de leur noyau aromatique. Ce degré de méthoxylation est déterminant lors de l'étape de polymérisation quant au type de liaison, condensée ou non-condensée, existant entre unités adjacentes. Le type de liaison formée va déterminer la "solidité" de la lignine et sa résistance aux traitements chimiques lors d'une utilisation technologique. La polymérisation des monolignols est catalysée par des oxydases, peroxydases ou laccases, qui génèrent des radicaux libres, qui s’assemblent ensuite spontanément pour former le polymère de lignine.

Parmi la cinquantaine de gènes identifiés codant des laccases chez le peuplier, 17 sont exprimés dans le bois au cours de la lignification. Treize d’entre eux sont la cible du microARN miR397a, un régulateur négatif de l’expression des gènes de laccase. Nous avons produit des peupliers transgéniques sur-exprimant miR397a (OE miR397a) présentant à la fois une diminution de l’expression des gènes de laccase cibles et une réduction des teneurs en lignines. Nous avons également produit avec l’outil CRISPR-Cas9 des lignées de peupliers (wt ou OE miR397a) éditées qui sont KO pour des combinaisons de six gènes de laccases impliquées dans la lignification, dont certaines ne sont pas cibles de miR397a. Ces lignées sont plus ou moins affectées dans la lignification et éventuellement dans la formation du bois et dans la physiologie de l’arbre. L’analyse de ces lignées, qui constitue l’objet du stage, permettra de déterminer l’importance des différentes laccases dans le processus de lignification.

Le stage est financé par le projet ANR DeOx (2022-2026).

Objectif et plan de recherche

Le stage portera sur la caractérisation moléculaire et biochimique des lignées de peuplier (wt ou OE miR397a) éditées pour différentes laccases impliquées dans la lignification.

Les analyses moléculaires consisteront à caractériser les éditions obtenues en déterminant combien de gènes de laccase sont édités et si pour chacun de ces gènes, l’édition est mono- ou bi-allélique. Pour cela les fragments de gènes ciblés seront amplifiés par PCR puis envoyés au séquençage. Des outils bioinformatiques seront utilisés si nécessaire pour déconvoluer les séquences en cas de mélange et déterminer les allèles édités.

Les caractérisations histologiques permettront d’évaluer l’impact de l’édition de telle ou telle laccase sur l’anatomie du bois, et sur la teneur en lignines et leur qualité : le stagiaire réalisera des coupes histologiques, soumises à différentes colorations, classiques pour les observations anatomiques et spécifiques aux lignines.

Les analyses biochimiques consisteront à déterminer si la lignine des peupliers édités est modifiée en quantité ou en qualité. La teneur en lignine sera mesurée par la méthode Klason (mesure de la quantité de lignine) et par thioacidolyse (mesure de la composition en monolignols H, G et S. Les lignées les plus prometteuses feront l’objet de test de saccharification avec ou sans traitement pour évaluer leur potentiel pour la production de bioéthanol

Une partie du matériel a été élevé en serre et prélevé cette année : il sera donc disponible dès le début du stage. Le reste du matériel sera acclimaté en tout début d’année, avec un prélèvement des jeunes plants prévu au cours du stage.

Techniques

Collecte des échantillons sur des arbres élevés en serre S2/L2

Analyses moléculaires : extraction ADN, PCR, séquençage, bioinformatique.

Analyses histologiques : coupe au microtome, coloration histochimique (safranine/bleu alcyan, de Weisner, de Maüle), observation au microscope optique et en fluorescence

Analyses biochimiques : broyage, extraction et purification d’échantillons pour analyses biochimiques, dosage des lignines par la méthode Klason, analyse SPIR en MIR et NIR, test de saccharification.

Nota : le dosage en thioacidolyse des proportions entre monolignols sera réalisé dans un autre laboratoire (labo INRAE BIA à Nantes).

 

Equipe d’accueil : Equipe Équipe Génomique Fonctionnelle, des Populations et Prédiction, UMR INRAE ONF BioForA

Encadrement : Gilles Pilate, gilles.pilate@inrae.fr, Françoise Laurans, francoise.laurans@inrae.fr et Nathalie Boizot, nathalie.boizot@inrae.fr

Le stagiaire sera également encadré au laboratoire par Justine Corret (analyses moléculaires) et Nassim Belmokhtar (tests de saccharification)

L’essentiel des expérimentations aura lieu au Laboratoire d’Ingéniérie Cellulaire de l’Arbre et sur le plateau technique Phénobois sur le site d’Orléans du Centre INRAE Val de Loire.

 

Publications pertinentes du laboratoire

Duruflé, H. Déjardin, A. Jorge, V. Pégard, M. Pilate, G. Rogier, O. Sanchez, L. Segura, V. (2025) Natural variation in chalcone isomerase defines a major locus controlling radial stem growth variation among Populus nigra populations. Peer Community Journal, 5, e50. https://doi.org/10.24072/pcjournal.559 

du Pasquier J, Zoghlami A, Naudin Y, Déjardin A, Pilate G, Paës G, Perré P (2025) Cinnamyl alcohol dehydrogenase downregulation in poplar wood increases saccharification after dilute acid pretreatment: a key role for lignin revealed by a multimodal investigation. Biotechnol. Biofuels Bioprod. 18, 30 (2025). https://doi.org/10.1186/s13068-025-02623-8 

De Meester, B., Van Acker, R., Wouters, M., Traversari, S., Steenackers, M., Neukermans, J., Van Breusegem, F., Déjardin, A., Pilate, G. and Boerjan, W. (2022), Field and saccharification performances of poplars severely downregulated in CAD1. New Phytol, 236: 2075-2090. https://doi.org/10.1111/nph.18366  

Lapierre C, Sibout R, Laurans F, Lesage-Descauses MC, Déjardin A, Pilate G, 2021. The PMT-driven p -coumaroylation of poplar lignins impacts lignin structure and improves wood saccharification. Plant Physiology, 187:1374-1386. https://doi.org/10.1101/2021.02.16.431462

Nabuqi, Nuoendagula, Wu S, Takata N, Sakamoto S, Yamamoto M, Uesugi M, Déjardin A, Pilate G, Taniguchi T, Mitsuda N, Kajita S, 2020. Simultaneous manipulation of lignin structure and secondary cell wall formation in transgenic poplar. Journal of Wood Science, 66: 56 https://doi.org/10.1186/s10086-020-01902-2

van Acker R, Déjardin A, Desmet S, Lennart Hoengenaert L, Vanholme R, Morreel K, Laurans F, Kim H, Santoro N, Foster C, Goeminne G, Légée F, Lapierre C, Pilate G, Ralph J, Boerjan W, 2017. Different metabolic routes for coniferaldehyde and sinapaldehyde in CAD1-deficient poplar. Plant Physiol. 175:1018-1039. https://doi.org/10.1104/pp.17.00834 

Expérimentation en milieu confiné

 

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